Preparasi Kromosom Teknik Jaringan Padat

Abstrak

Analisa kromosom dapat digunakan untuk menentukan tingkat ploidi (diploid, triploid, dan sebagainya) dan karakteristik suatu spesies yang dikenal dengan teknik karyotip. Praktikum ini bertujuan agar praktikan mampu melakukan preparasi kromosom teknik jaringan padat dan dapat mengamati, mengetahui serta menganalisa jumlah dan bentuk kromosom untuk menentukan tingkat ploidi dan karakteristik spesies ikan yang diamati. Preparat kromosom juga berguna dalam analisis karyotip yang bermanfaat untuk mengetahui adanya penyakit genetik, mutasi kromosom, mengidentifikasi spesies, mengidentifikasi hybrid hasil persilangan, pemantauan jenis kelamin dan mengidentifikasi tingkat ploidi suatu organisme. Tahapan-tahapan untuk mendapatkan kromosom melalui teknik jaringan padat meliputi perlakuan kolkisin, perlakuan hipotonik, fiksasi, pembuatan preparat, dan pengamatan. Ikan mas (Cyprinus carpio) dan ikan nila (Oreochromis niloticus) yang digunakan dalam praktikum masing-masing memiliki 100 dan 46 kromosom. Jumlah kromosom terbanyak ikan mas yang dihitung adalah 84 yaitu pada insang, sedangkan yang tersedikit adalah 61 juga pada insang. Jumlah kromosom terbanyak yang ditemukan pada ikan nila adalah 46 pada sirip dan insang, sedangkan yang terkecil adalah 26 pada sirip. Perbedaan jumlah kromosom tersebut (ikan mas 100 kromosom dan ikan nila 46 kromosom) menunjukkan bahwa karakteristik kedua ikan tersebut berbeda.

Pendahuluan

Analisa kromosom dapat digunakan untuk menentukan tingkat ploidi (diploid, triploid, dan sebagainya) dan karakteristik suatu spesies yang dikenal dengan teknik karyotip. Pengamatan ukuran serta jumlah kromosom dapat dilakukan dengan pembuatan preparat kromosom. Untuk itu sangat diperlukan ketrampilan khusus dalam pembuatan preparat kromosom. Pembuatan preparat kromosom dapat dilakukan dengan dua cara yaitu dengan teknik jaringan padat dan teknik kultur darah. Dalam praktikum ini teknik yang diterapkan adalah preparasi kromosom teknik jaringan padat, karena lebih murah dan tidak membutuhkan waktu yang terlalu lama.

Tujuan dari praktikum ini adalah agar praktikan mampu melakukan preparasi kromosom teknik jaringan padat dan dapat mengamati, mengetahui serta menganalisa jumlah dan bentuk kromosom untuk menentukan tingkat ploidi dan karakteristik spesies ikan yang diamati.

Metodologi

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Jumat, 29 Februari dan 7 Maret 2008 bertempat di Laboratorium Genetika Ikan departemen Budidaya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor.

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah timbangan, mikroskop binokuler, alat bedah, gelas obyek, gelas obyek cekung, hot plate, kertas tissue, pipet tetes, tusuk gigi, refrigerator dan botol film.

Bahan-bahan yang digunakan adalah kolkisin (C₂₂H₂₅NO₆), etanol (C₂H₅OH), kalium klorida, asam asetat glacial (CH₃COOH), giemsa, akuades, ikan mas (Cyprinus carpio), dan ikan nila (Oreochromis niloticus).

Prosedur kerja yang pertama adalah perendaman dengan kolkisin dan pengawetan jaringan. Ikan direndam dalam larutan kolkisin 0,07% selama 6-9 jam. Selama perendaman ikan dibiarkan berenang dalam wadah dengan aerasi yang baik. Setelah itu ikan dibunuh, kemudian diambil jaringan tubuhnya pada bagian insang dan sirip ekor. Potongan jaringan tersebut di rendam dalam larutan KCl 0,075 M pada botol film selama 60 menit pada suhu ruang. Larutan KCl diganti setiap 30 menit selama waktu perendaman. Selanjutnya jaringan difiksasi dengan larutan Carnoy selama 60 menit, dan dilakukan penggantian larutan setiap 30 menit. Kemudian dilanjutkan dengan pembuatan preparat. Setelah disimpan dalam refrigerator selama satu minggu, jaringan yang telah difiksasi diambil dengan menggunakan pinset dan disentuhkan pada kertas tissue untuk menghilangkan larutan fiksatif. Jaringan tersebut diletakkan di atas gelas objek cekung dan ditambahkan 3-4 tetes asam asetat 50 %. Setelah itu jaringan digerak-gerakkan dengan menggunakan pinset secara hati-hati hingga keruh yang berarti telah terbentuk suspensi sel. Gelas objek yang akan digunakan sebagai preparat sebelumnya direndam di dalam alkohol 70 % minimal 2 jam. Suspensi yang terbentuk diambil dengan pipet tetes, lalu diteteskan di atas gelas objek yang ditempatkan di atas hot plate dengan suhu 45-50 ºC, dan dihisap kembali dengan cepat setelah terbentuk lingkaran dengan diameter 1-1,5 cm. Langkah selanjutnya adalah pewarnaan preparat. Pada setiap gelas objek sebaiknya dibuat 3 lingkaran. Preparat yang telah jadi diwarnai dengan larutan giemsa 20 % sebanyak 3-5 tetes lalu disebarkan hingga menutupi lingkaran dengan menggunakan tusuk gigi. Setelah merata, preparat disimpan selama 20 menit pada suhu kamar. Setelah itu, preparat dibilas dengan akuades lalu dibiarkan mengering, kemudian bisa diamati di bawah mikroskop.

Hasil dan Pembahasan

Hasil dari praktikum ini dapat dilihat pada tabel berikut.

Tabel 1. Hasil analisa kromosom pada preparat yang telah dibuat.

Kelompok	Ikan Mas (Cyprinus carpio)		Ikan Nila (Oreochromis niloticus)
	Sirip	Insang	Sirip	insang
1.				42/36/ø
				ø/ø/ø
			ø/ø/ø
		84/ø/ø
	ø/ø/ø
			ø/ø/ø
2				46/ø/ø
		ø/ø/ø
				42/ø/ø
			ø/ø/ø
	ø/ø/ø
			ø/ø/ø
3			ø/ø/ø
				ø/ø/ø
		ø/ø/ø
	ø/ø/ø
			ø/ø/ø
				ø/ø/ø
4	ø/ø/ø
		ø/ø/ø
		61/67/ø
			ø/ø/ø
				ø/ø/ø
	ø/ø/ø
5		ø/ø/ø
				ø/ ø/ ø
	ø/ø/ø
		ø/ø/ø
			26/46/40
	ø/ø/ø

Kromosom adalah suatu struktur makromolekul yang berisi DNA di mana informasi genetik dalam sel disimpan (Fri, 2008). Kromosom tersuspensi dalam medium semifluida pada membran nukleus. Kromosom tampak sebagai struktur memanjang dan tidak mudah diamati dengan mikroskop cahaya. Dalam keadaan seperti biasa disebut kromatid (Kimball, 1983).

Praktikum ini mengamati kromosom yang berasal dari insang dan sirip ekor ikan mas (Cyprinus carpio) dan ikan nila (Oreochromis niloticus). Sebenarnya kromosom yang diamati dapat berasal dari beberapa sumber sel. Masing-masing sumber memiliki kelebihan dan kekurangan. Insang, sirip, epitel sisik dan epitel insang kurang baik untuk digunakan karena jaringan ini biasanya sedikit sekali sel yang membelah. Ginjal merupakan jaringan yang baik untuk digunakan dalam pembuatan preparat kromosom karena sel-selnya aktif membelah. Hal ini berkaitan dengan fungsinya sebagai pusat pembentukan sel darah merah atau selnya sering mengalami kerusakan (Denton, 1973 dalam Sucipto 2008). Dalam praktikum ini ginjal tidak digunakan karena ikan yang diambil jaringan tubuhnya masih kecil, sehingga ginjalnya sulit diambil.

Morfologi dan jumlah yang lengkap dari kromosom mudah diamati sewaktu metafase karena saat itu kromosom berada dalam keadaan kondensasi maksimum (Yatim, 1991 dalam Sucipto, 2008).

Perlakuan yang berkaitan dengan pembuatan preparat kromosom meliputi penghentian pembelahan sel (mitotic inhibitor), perlakuan hipotonik, fiksasi, pewarnaan dan penutupan preparat (Denton, 1973 dalam Sucipto, 2008). Dalam praktikum ini perlakuan-perlakuan tersebut juga dilakukan dan disebut teknik jaringan padat. Masing-masing perlakuan mempunyai tujuan tertentu.

Kromosom tampak jelas pada waktu metafase, maka pada saat inilah pembelahan sel harus dihambat. Bahan yang paling sering digunakan sebagai penghambat pembelahan mitosis adalah kolkisin. Kolkisin adalah suatu alkaloida hasil ekstraksi umbi tanaman Colcicum autumnale yang berpengaruh unik, yaitu meniadakan pembentukan gelendong inti dan menghentikan pembelahan mitosis pada stadium metafase, fase dimana kromosom berkontraksi maksimal dan nampak paling jelas (Denton, 1973; Sharma, 1976; Suryo, 1994 dalam Sucipto, 2008). Konsentrasi normal yang biasa digunakan untuk jaringan ikan berkisar antara 0,01-0,1% untuk periode waktu 1-6 jam (Denton, 1973 dalam Sucipto, 2008). Selain kolkisin dapat juga menggunakan kolsemid (deacethymethyl colcicine), velban (vinblastine sulfate), asenaften, kloral hidrat, coumarin dan turunannya, askalin, isopsoralen, oksiquinalen, dan P-diklorobenzen (Sharma, 1976 dalam Sucipto, 2008). Pada praktikum ini digunakan larutan kolkisin 0,07% yang dibuat dengan melarutkan 700 mg kolkisin dalam 1 liter akuades.

Perlakuan hipotonik bertujuan agar sel-sel membesar dan kromosom-kromosom menyebar letaknya (Denton, 1973; Sharma, 1976 dalam Sucipto, 2008). Larutan hipotonik dapat dibuat dari campuran akuades, sodium sitrat dan potassium klorid. Lama perlakuan bergantung pada suhu dan konsistensi jaringan/sel yang digunakan (Denton, 1973; Sharma, 1976 dalam Sucipto, 2008). Praktikum ini menggunakan larutan hipotonik 0,075 M (1 liter) yang dibuat dengan melarutkan 5,6 gram KCl dalam 1 liter akuades.

Fiksasi merupakan perlakuan untuk mematikan sel tanpa merusak bentuk dan kandungannya (Denton, 1973; Sharma, 1976 dalam Sucipto, 2008). Menurut Gunarso (1989) fungsi lain dari larutan fiksatif adalah menaikkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan kasar yang merupakan komponen cairan fiksatif. Larutan fiksatif yang paling sering digunakan adalah campuran methanol dengan asam asetat glacial pada perbandingan 3:1 (v/v). Larutan ini harus dalam keadaan segar jika akan digunakan (Wilson dan Morrison, 1962; Denton, 1973; Phillips et al., 1986; Chaves et al., 1991 dalam Sucipto, 2008). Fiksasi dalam praktikum ini juga menggunakan campuran methanol dengan asam asetat glacial pada perbandingan 3:1 (v/v) yang disebut larutan carnoy.

Pada tahap pembuatan preparat digunakan hot plate yang berfungsi mengeringkan suspensi sel di atas preparat, hal ini berguna agar sel melekat dengan erat sehingga tidak terlepas saat proses berikutnya.

Pewarnaan dilakukan agar kromosom mudah diamati di bawah mikroskop (Denton, 1973; Sharma, 1976 dalam Sucipto, 2008). Giemsa merupakan pewarna yang paling sering digunakan untuk mewarnai kromosom (Denton, 1973; Sharma, 1976; Chaves et al., 1991 dalam Sucipto, 2008) meskipun mekanisme pewarnaannya tidak bersih (Macgregor dan Valley, 1983 dalam Sucipto, 2008). Giemsa digunakan untuk jenis preparat ulasan tipis maupun tebal (Gunarso, 1989). Komponen aktif Giemsa berupa molekul eosin Y dan biru metilen (Sharma, 1976; Magregor dan Valley, 1983 dalam Sucipto, 2008). Kualitas hasil pewarnaan bervariasi tergantung perbandingan pewarna yang digunakan (Sharma, 1976 dalam Sucipto, 2008). Pewarnaan dalam praktikum ini menggunakan larutan giemsa 20% yang dibuat dengan mencampurkan giemsa dan akuades dengan perbandingan 2 : 8.

Hasil pengamatan menunjukkan bahwa tidak semua praktikan berhasil menemukan kromosom pada preparat buatannya. Beberapa praktikan yang menemukan kromosom pada preparatnya tidak memperoleh jumlah kromosom sesuai dengan jumlah kromosom sebenarnya. Jumlah kromosom terbanyak ikan mas yang dihitung adalah 84 yaitu pada insang, sedangkan yang tersedikit adalah 61. Jumlah kromosom terbanyak yang ditemukan pada ikan nila adalah 46, sedangkan yang terkecil adalah 26. Jumlah kromosom ikan mas diploid adalah 100, sedangkan ikan nila adalah 46 (Fri, 2008). Namun ada dua orang praktikan yang menemukan jumlah kromosom dari insang ikan nila pada preparatnya sama dengan jumlah yang sebenarnya yaitu 46. Kegagalan praktikum dipengaruhi banyak faktor, faktor utama penyebabnya adalah kesalahan prosedur kerja praktikan. Kesalahan-kesalahan yang terjadi diantaranya adalah terlalu cepat atau terlalu lama pada saat meneteskan suspensi sel pada kaca preparat di atas hot plate. Terlalu cepat akan mengakibat kan preparat yang terbentuk terlalu tipis sehingga sel sulut diamati, sedangkan terlalu cepat dapat menyebabkan preparat terlalu tebal sehingga sel yang akan diamati bertumpuk dan sulit diamati.

Setelah mengetahui jumlah kromosom, hal yang sebenarnya dapat dilakukan adalah menganalisis kromosom untuk mengetahui karakteristik spesies yang diamati (karyotip). Analisis karyotip bermanfaat untuk mengetahui adanya penyakit genetik, mutasi kromosom, mengidentifikasi spesies, mengidentifikasi hybrid hasil persilangan, pemantauan jenis kelamin dan mengidentifikasi tingkat ploidi suatu organisme (Carman, 1990 dalam Sucipto, 2008). Hasil yang lebih menyakinkan dalam penyusunan karyotipe diperoleh dari hasil banding (Eldridge, 1985 dalam Sucipto, 2008). Namun hal ini tidak dilakukan karena masih minimnya kemampuan praktikan untuk melakukannya.

Kesimpulan

Kromosom terlihat jelas dan mudah diamati pada saat pembelahan sel secara mitosis pada tahap metafase. Tahapan-tahapan untuk mendapatkan kromosom melalui teknik jaringan padat meliputi perlakuan kolkisin, perlakuan hipotonik, fiksasi, pembuatan preparat, dan pengamatan. Praktikum belum sepenuhnya berhasil karena hanya dua orang praktikan yang berhasil menemukan 46 kromosom ikan nila.

Daftar Pustaka

Fri. 2008. Pengertian Kromosom dan Jumlah Kromosom Pada Manusia, Hewan Dan Tumbuhan. www.oragnisasionline.org. [10 Maret 2008].

Gunarso, Wisnu. 1989. Mikroteknik. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Ilmu Hayat Institut Pertanian Bogor.

Kimball, John W. 1983. Biologi. Jilid 1. Jakarta: Erlangga.

Sucipto, Adi. 2008. Preparasi Kromosom. www.adisucipto.wordpress.com. [10 Maret 2008].